技术文章您的位置:网站首页 >技术文章 >荧光原位杂交FISH技术服务

荧光原位杂交FISH技术服务

发布时间:2012-02-21   点击次数:3045次

FISH技术:荧光标记的原位杂交技术

 

  1974年Evans将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用,提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交,即FISH技术。1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上,标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代,随着人类基因组计划的进行,由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要,FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。

 

  1.原理

 

  将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛,可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

 
  

肺肿瘤细胞FISH

  2.实验流程

 

  FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。

 

  3.特点

 

  原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高,可以通过延长曝光时间加强信号强度,故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足,这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系,具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定,一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列,其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化,也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

 

  缺点:不能达到100%杂交,特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

 

  4.应用

 

  该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位,而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。

根生实验流程

一、探针及标本的变性
(1)探针变性:将探针在75℃怛温水浴中温育5min,立即置0℃,5~10min,使双链DNA探针变性。

(2)标本变性:

①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2~3h。(经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片)。

②取出玻片标本,将其浸在70~75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2~3min。
③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水,每次5min,然后空气干燥。
二、杂交:
将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上,盖上18×18盖玻片,用Parafilm封片,置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜(约15~17h)。由于杂交液较少,而且杂交温度较高,持续时间又长,因此为了保持标本的湿润状态,此过程在湿盒中进行。
三、洗脱:此步骤有助于除去非特异性结合的探针,从而降低本底。
(1)杂交次日,将标本从37℃温箱中取出,用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
(2)将已杂交的玻片标本放置于已预热42~50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次,每次5min。
(3)在已预热42~50℃的1×SSC中洗涤3次,每次5min。
(4)在室温下,将玻片标本2×SSC中轻洗一下。
四、杂交信号的放大:
(1)在玻片的杂交部位加150mL封闭液I,用保鲜膜覆盖,37℃温育20min。
(2)去掉保鲜膜,再加150mL avidin-FITC于标本上,用保鲜膜覆盖,37℃继续温育40min。
(3)取出标本,将其放入已预热42~50℃的洗脱液中洗涤3次,每次5min。
(4)在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II,覆盖保鲜膜,37℃温育20min。
(5)去掉保鲜膜,加150mL antiavidin于标本上,覆盖新的保鲜膜,37℃温育40min。
(6)取出标本,将其放入已预热42~50℃的新洗脱液中,洗涤3次,每次5min。
(7)重复步骤(1)、(2)、(3),再于2×SSC中室温清洗一下。
(8)取出玻片,自然干燥。
(9)取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上,盖上盖玻片。
五、封片:
    可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol(可使封片液产生自封闭作用),为防止盖片与载片之间的溶液挥发,可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20~-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。
六、荧光显微镜观察FISH结果:
先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野,然后打开荧光激发光源,FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色,而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列,因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性,即使在末分裂的细胞中,也可以观察到明显的杂交信号。照相记录实验结果
 

联系我们

contact us

咨询电话

15216781845

扫一扫,关注我们

返回顶部




扫一扫访问手机站扫一扫访问手机站
访问手机站